Молекулярно-генетические методы
Молекулярно-генетические методы - большая и разнообразная
группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре
участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной
последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные
манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов
является получение образцов ДНК. Источником геномной ДНК могут быть любые
ядросодержащие клетки. На практике чаще используют лейкоциты, хорион,
амниотические клетки, культуры фибробластов. Возможность проведения
молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного
биологического материала является методическим преимуществом методов данной
группы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных исследований
и может долго сохраняться в замороженном виде. Во многих случаях для успешной
диагностики болезни достаточно исследовать небольшой фрагмент генома. Выделение
таких фрагментов стало возможным благодаря открытию ферментов - рестриктаз,
которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах.
Применение этих ферментов в эксперименте дает возможность
получить относительно короткие фрагменты ДНК, в которых легко можно определить
последовательность нуклеотидов. Получение достаточного количества таких
фрагментов осуществляется путем амплификации (умножения) ДНК при помощи
полимеразной цепной реакции. Различают прямую и косвенную ДНК-диагностику
моногенных наследственных болезней. При прямой диагностике предметом анализа
являются мутации гена. В ДНК-диагностике в настоящее время используются
разнообразные прямые методы. Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие
длину амплифицированных фрагментов ДНК, которые выявляются при
электрофоретическом анализе. Для выявления точковых мутаций, небольших делеций и
инверсий в исследуемых генах используют методы, при помощи которых можно
проанализировать уникальную последовательность ДНК. Примером может служить метод
секвенирования - определение нуклеотидной последовательности ДНК. Любые типы
мутаций могут быть обнаружены путем прямого секвенирования мутантной ДНК. Для
некоторых генов, имеющих небольшие размеры, этот метод с успехом применяется как
основной метод сканирования мутаций. Главное преимущество прямых методов
диагностики - почти 100 % эффективность.
Косвенное выявление мутаций применяется в тех случаях, когда
нуклеотидная последовательность гена еще не известна, но имеется представление о
положении гена на генетической карте. Косвенная ДНК-диагностика сводится к
анализу полиморфных генетических маркеров у больных и здоровых членов семьи.
Маркеры должны быть расположены в том хромосомном регионе, где и ген болезни.
Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких
аллельных вариантах. Отличия могут быть по составу нуклеотидов, по числу
динуклеотидных повторов. На основе вариабельности маркерных участков ДНК можно
дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного варианта
маркера, сцепленного с геном болезни. Благодаря анализу полиморфных генетических
маркеров можно определить и проследить в поколениях хромосому, несущую
патологический ген. Технические приемы в косвенной диагностике те же, что и в
прямой диагностике (получение ДНК, электрофорез и другие). Главный недостаток
косвенных методов диагностики - обязательное предварительное изучение генотипа
как минимум одного пораженного родственника.
|
