ЛЕКЦИИ: ВВЕДЕНИЕ В ФИЗИКУ БЕЛКА
 

 

Лекция 7

           Разобравшись с элементарными взаимодействиями,  —  рассмотрим сегодня вторичную структуру белков. Прежде всего у нас речь пойдет о регулярных вторичных структурах  —  об a-спиралях и о b-структуре,  —  но не только о них.

           Укладка a и b-структур в глобулу определяет третичную структуру белка (Рис.7-1). Эти вторичные структуры отличаются определенными, периодическими конформациями главной цепи   —   при разнообразии конформаций боковых групп.
     
     
     

           Рис.7-1. Вторичная структура полипептидной цепи (a-спираль и тяж b-листа) и третичная структура белковой глобулы.
     
     

           Начнем со спиралей. Они могут быть левые и правые (Рис.7-2), у них может быть разный период и шаг. Правые (R) спирали приходят к нам, завиваясь против часовой стрелки (что отвечает положительному отсчету угла в тригонометрии); левые (L)  —  приходят, вращаясь по стрелке.
     
     
     

           Рис.7-2. Правые (R) и левые (L) спирали. Под ними показан отсчет положительного угла в тригонометрии: при этом "близкая к нам" стрелка вращается против хода часов.
     
     

           Важнейшие спирали в полипептидной цепи держатся водородными связями, где С=О группы остова полипептида связаны с лежащими от них в направлении С-конца цепи H-N группами. В принципе, возможны следующие спирали, стянутые Н-связями (Рис.7-3): 27, 310, 413 (обычно именуемая a) и 516 (она же p). Здесь в названии "27"  —  "2" означает связь со 2-м по цепи остатком (см. Рис.7-3), а "7"  —  число атомов в цикле (O......H-N-C'-Ca-N-C'), замыкаемом этой связью. Тот же смысл имеют цифры и в названии других спиралей.
     
     
     

           Рис.7-3. Водородные связи (они показаны стрелками), характерные для разных спиралей.
     
     

           Какие из этих спиральных структур преобладают в белках? a-спирали. Почему? Ответ на этот вопрос дает карта Рамачандрана для типичного аминокислотного остатка  —  аланина (Рис.7- 4), на которой отмечены конформации, периодическое повторение которых приводит к завязыванию изображенных на Рис.7-3 водородных связей.
     
     

           Рис.7-4. Конформации различных вторичных структур на фоне карты разрешенных и запрещенных конформаций аминокислотных остатков. 27R, 27L: правая и левая спираль 27; 310R, 310L: правая и левая спираль 310; aR, aL  —  правая и левая a-спираль; pR, pL  —  правая и левая p-спираль. b  —  b-структура (подробности см. на Рис.7-8б). Р  —  спираль Poly(Pro)II.   —  конформации, разрешенные для аланина (Ala);   —  области, разрешенные лишь для глицина, но не для аланина и других остатков;   —  области, запрещенные для всех остатков. j и y  —  углы внутреннего вращения в белковой цепи.
     
     

           Видно, что только спираль aR (a-правая) лежит достаточно глубоко внутри области, разрешенной для аланина (и для всех других остатков). Другие спирали лежат либо на краю этой области (например, левая спираль aL или правая спираль 310), где конформационные напряжения уже возрастают, либо в области, доступной только глицину.
           Поэтому можно ожидать, что именно правая a-спираль должна быть, как правило, более стабильной, и потому преобладать в белках  —  что и наблюдается. В правой a-спирали (Рис.7-5) все атомы упакованы оптимально: плотно, но без напряжений; поэтому не удивительно, что в белках таких спиралей много, а в фибриллярных белках они достигают гигантской длины и включают сотни аминокислотных остатков.
     
     
     

           Рис.7-5. Правая a-спираль. (а) Атомарная структура. R  —  боковые группы. Голубые линии  —   водородные связи. (б) Схематическое изображение одного витка той же a-спирали, вид с торца. Стрелка показывает поворот спирали (в расчете на один остаток) по мере ее приближения к нам. Картинка (а) взята из [3] и адаптирована.
     
     

           Левых a-спиралей в белках практически нет. Нет и спиралей 27, которые, мало того что лежат на самом краю разрешенной области, но еще имеют энергетически невыгодный, почти прямой угол схождения N-H и О=С групп.
           Практически нет в белках и спиралей p. Они тоже лежат на самом краю разрешенной области, да еще и витки в них слишком широки, так что p-спирали имеют энергетически невыгодную пустую "дырку" на оси. А вот спирали 310 (в основном  —  правые,  —  левые пригодны практически лишь для глицинов) в белках есть  —   правда, в виде коротких (из трех-четырех остатков) и деформированных фрагментов (из-за стерических напряжений: слишком тугая спираль!  —  соответствующая ей конформация лежит на самом краю разрешенной области).

           Отметим одно свойство спиралей, хорошо видное на Рис.7-5а: на их N-конце сидят свободные от внутриспиральных водородных связей Н атомы N-H групп, а на С-конце  —  свободные от водородных связей О атомы С=О групп. Так как электронное облако с Н атома частично стянуто электроотрицательным N атомом, а электроотрицательный О атом сам стягивает электрон с С' атома,  —  N-конец спирали несет положительный, а С-конец  —  отрицательный парциальный заряд. То есть спираль представляет собой длинный диполь: величина суммарного (поставляемого тремя NH-группами) парциального "+" заряда на ее N-конце составляет около половины протонного, а "-" заряда на С-конце a-спирали  —  около половины электронного заряда.

           Теперь рассмотрим регулярные структуры без водородных связей внутри каждой, но соединенные водородными связями между собой.
     
     


           Рис.7-6. Схема хода цепи и расположения водородных связей в параллельной b, антипараллельной b и смешанной b  b-структуре. Видно, что Н-связи одного остатка в b-тяже направлены одну сторону, следующего  —  в противоположную, и т.д.
     

     

           Почти вытянутые (все углы в главной цепи  —  почти trans), слегка скрученные цепи образуют b-структуру. Она бывает (Рис.7-6) параллельной (b), антипараллельной (b) и смешанной (состоящей из b и b).
           b-структура стянута водородными связями (символы / , \ и | на схемах 7-6). Она существует в виде более или менее крупных листов. Так как поверхность b структуры  —  рифленая, ее еще называют "складчатой b-структурой" (Рис.7-7).
     
     
     

           Рис.7-7. Лист b структуры имеет складчатую поверхность. Боковые группы (см. маленькие отростки) расположены на складках; каждая обращена в ту же, что и складка, сторону, т.е. направленные вниз и вверх боковые группы чередуются вдоль b-тяжа. Картинка взята из [3] и адаптирована.
     
     

           b-структурные листы всегда несколько скручены (Рис.7-8а) из-за того, что несколько скручены (Рис.7-8б) отдельные b-тяжи  —  и потому по ходу тяжа несколько меняется направленность водородных связей. А тяжи, в свою очередь, скручены из-за того, что наиболее энергетически выгодная конформация остатков с боковыми группами сдвинута к центру стерически разрешенной области (Рис.7-8в). Скрученность отдельного b-тяжа  —  левая (у L аминокислот!  —  у D было бы наоборот): вы видите (Рис.7-8б), что боковые группы тяжа поворачиваются по часовой стрелке (на »-165o на каждый остаток) по мере приближения тяжа к нам.
           В результате, поворачиваются и Н-связи (на »-165o на каждый остаток, т.е. на -330o=+30o на пару остатков - повторяющуюся единицу b-структуры), так что угол между соседними тяжами b-структуры (если смотреть с кромки листа, Рис.7-8а) обычно составляет около -25о ("минус", как всегда, означает, что ближний к нам b-тяж повернут по часовой стрелки относительно более далекого). Таким образом, b-лист имеет левое скручивание, если смотреть с края этого листа (и правое, если смотреть вдоль b-тяжей на поворот линии Н-связей).
     
     
     

           Рис.7-8. (а) Скрученность b-листа. b-тяжи изображены стрелками, водородные связи между ними  —  голубыми линиями. (б) Схематическое изображение одного витка b-тяжа, вид с торца. Кружки  —  боковые группы; их номера возрастают по мере удаления от читателя. Голубые линии укаывают направление С=О групп, завязывающих Н-связи в листе, большей стрелкой  —  поворот b-тяжа при приближении к нам на один остаток, меньшей стрелкой  —  поворот направленных в одну сторону водородных связей при приближении к нам на два остатка. (в) Конформация идеальной (не скрученной) параллельной () и антипараллельной () b-структуры для поли(Gly), и усредненная конформация реальной (сложенной из L аминокислот) скрученной (twist) b-структуры. Пунктир показывает область энергетического минимума для отдельно взятого остатка Ala; контуром показаны границы области разрешенных конформаций этого остатка. Диагональ jy-карты соответствует плоской периодичной структуре, имеющей 2 остатка на виток. Над диагональю лежат левые (L) спирали, под ней  —  правые (R). Картинки (а), (в) взяты из [3] и адаптированы.
     
     

           Есть спирали и без водородных связей, где плотная (а значит  —  энергетически выгодная) упаковка держится чисто на Вандерваальсовых контактах. Это  —  полипролиновая спираль. При этом три скрученные в довольно растянутую левую спираль цепи образуют правую суперсуперспираль  —  они плотно закручиваются друг вокруг друга. Из двух возможных типов полипролиновой спирали для нас важна спираль poly(Pro)II: она реализуется в коллагене. В этой спирали пептидные группы пролинов находятся в обычной (trans) конформации. Отложим более подробное рассмотрение коллагеновой спирали до соответствующего места курса, а пока ограничимся общим ее видом (Рис.7-9) и отметим на Рис.7-4 область соответствующей ей конформации цепи: видно, что она довольно близка к b структуре.
     
     
     

           Рис.7-9. Общий вид тройной правой суперспирали из левых спиралей Poly(Pro)II.
     
     

           Параметры наиболее важных регулярных вторичных структур белковых цепей суммируются в следующей таблице:
     

     

    Таблица 7/1. Основные геометрические параметры наиболее распространенных в белках вторичных структур. 
    Структура H-связь Остаток/виток Смещение/остаток () f y
    Спираль aR CO0—HN+4 +3.6 1.5 -600 -450
    Спираль (310)R CO0—HN+3 +3 2.0 -500 -250
    Лист b меж цепей* -2.3 3.4 -1350 +1500
    Лист b меж цепей* -2.3 3.2 -1200 +1350
    Спираль Poly(Pro) II нет -3 3.0 -800 +1550

    * Расстояние между тяжами в b-листе: 4.8

    Примечание. Данные взяты из [3, 6]. Все цифры округлены. "+" означает правую спираль, "-"  —  левую.



           Кроме регулярных, в полипептидных цепях есть еще и нерегулярные вторичные структуры,  —  т.е. стандартные структуры, не образующие длинных периодических систем.
           Это  —  так называемые b-изгибы ("b"  —  потому, что они часто стягивают верхушки соседних b-тяжей в антипараллельных b шпильках). Характерный вид наиболее важных b-изгибов и конформации входящих в них остатков представлены на Рис.7-10. Сравните Рис.7-10в с Рис.7-4 и Таблицей 7/1, и обратите внимание на то, что изгибы I (и особенно III) близки по конформации к витку спирали 310.
     
     
     
     

           Рис.7-10. b-изгибы. (а) b-изгиб типа I (b-изгиб типа III очень на него похож и потому не нарисован отдельно). (б) b-изгиб типа II. Его основное отличие от b-изгиба I  —  переворот пептидной группы, соединяющей остатки i+1 и i+2. (в) Конформации фиксируемых водородной связью остатков i+1 и i+2 в b-изгибах. В b-изгибе III оба остатка i+1 и i+2 имеют одинаковую конформацию (отмечена жирной точкой). Конформации остатков i и i+3 в b-изгибах не фиксированы; они фиксируются b-структурой - если она прирастает из изгиба, как на рисунке (г), где дана схема b-шпильки с b-изгибом в ее вершине. Картинки (а), (б), (в) взяты из [3] и адаптированы.
     
     

           В заключение  —  несколько слов о том, как экспериментально обнаруживается вторичная структура.

           Конечно, если сделан рентген (или точный многомерный ЯМР) белка  —  вторичная структура берется из атомных координат.

           Впрочем, ЯМР (ядерный магнитный резонанс), который хорошо фиксирует сближенность (до 4  — 5 и менее ) ядер Н-атомов, позволяет определять вторичную структуру даже тогда, когда полную атомную структуру белка построить еще не удается.
           Метод ЯМР основан на возбуждении радиоволнами ориентированных в сильном магнитном поле ядер,   —  тех ядер, которые имеют нечетное число нуклонов (протонов и нейтронов): только они имеют спин и, вследствие этого,   —  магнитный момент. В белке это   —  природные "легкие" водороды (1H), а также вводимые изотопы (13С, 15N и т.д.). Магнитный резонанс наступает на радиочастоте, характерной для данного атома, причем эта частота слегка модифицируется его соседями по химическим связям и по пространству (что и позволяет судить, атом какого остатка возбудился). Возбужденное ядро может передать свое возбуждение соседнему с ним в пространстве ядру с магнитным моментом, и оно отрапортует о полученном возбуждении уже на своей частоте (что и позволит судить о сближенности этих двух магнитных ядер).
           Для a-спиралей особенно характерна сближенность H-атома группы CaH с H-атомом NH-группы 4-го от нее (к С-концу цепи) остатка, а для b-структуры  —  сближенность Н-атомов NH- и CaH-групп у остатков, непосредственно соседствующих по цепи, и у остатков, связанных Н-связями в b-листе (Рис.7-11).
     
     
     

           Рис.7-11. Сближенность («) ядер водородных атомов, наиболее характерная для a-спирали (а), параллельной (б) и антипараллельной (в) b-структуры. Индексы при атомах главной цепи в рисунке (а) показывают взаимное расположение остатков в цепи.
     
     

           Однако наиболее важную, пожалуй, роль в определении вторичной структуры играет метод кругового дихроизма (КД). Он не требует знания общей пространственной структуры белка. Наоборот, структурное исследование белка обычно начинается с получения спектров КД. Метод КД основан на различии в поглощении право- и левополяризованного света в спиралях различной закрученности. Из-за этого различия в поглощении плоскополяризованный свет превращается в эллиптически поляризованный.

           Характерные спектры эллиптичности в области "дальнего" ультрафиолета (190-240 нм) приведены на Рис.7-12. Показанные спектры зависят от асимметрии окружения пептидных групп и потому рапортуют о том, есть ли в белке вторичная структуре, какая, и сколько ее.
     
     
     
     

           Рис.7-12. Характерные формы спектров КД для полилизина в форме a-спирали (a), b-структуры (b) и неупорядоченного клубка (r). Картинка взята из [6] и адаптирована.
     
     

           Пептидные группы оптически возбуждаются в "дальнем УФ", при длине волны порядка 200 нм. Это  —  примерно вдвое большая длина волны, чем та, на которой возбуждаются отдельные атомы. Причина того, что пептидная группа возбуждается более длинноволновым (т.е. менее "жестким") светом,  —  в делокализации электронов пептидной группы по нескольким атомам, о чем мы уже говорили.

           Еще больше делокализованы электроны в ароматических группах  —  там они "размазаны" не по трем, как в пептидной группе, а по шести атомам. Спектры КД ароматических групп приходятся на длину волны ~250-280 нм (хотя "хвост" этих спектров доходит до ~220 нм). В этом диапазоне длин волн, ~250-280 нм, (в "ближнем" ультрафиолете) изучают асимметрию окружения ароматических боковых групп,  —  т.е. эффекты, связанные с образованием уже не вторичной, а третичной структуры белка.
           В скобках отмечу, что при еще большей делокализации электрона (в более крупных молекулах с кратными связями)  —   он начинает возбуждаться уже не ультрафиолетовым, а видимым светом (400- 600 нм): свечение таких молекул видно на глаз, т.е. они являются красителями.

           Кроме ультрафиолетовых спектров, для регистрации вторичной структуры полипептидов и белков используются инфракрасные спектры. Они отражают различия в колебаниях пептидных групп, вовлеченных и не вовлеченных в разные вторичные структуры (Рис.7-13). Эти измерения более сложны, чем измерения УФ-спектров, так как обычная вода (H2O) поглощает в той же области; поэтому такие измерения обычно проводятся в тяжелой воде (D2O). Кроме того, они требуют больше белка, чем измерения УФ-спектров, и более высоких концентраций белка в растворе.
     
     
     
     

           Рис.7-13. Характерные формы инфракрасных спектров пропускания, измеренных в тяжелой воде (D2O) для полилизина в форме a-спирали (a), b-структуры (b) и неупорядоченного клубка (r). Измерения, в данном случае, проводились в области "амид I", отражающей колебания С=О связи. Картинка взята из [6] и адаптирована.
     
     


ЛЕКЦИИ: ВВЕДЕНИЕ В ФИЗИКУ БЕЛКА


2007 Copyright © GenDNA.ru Мобильная Версия v.2015 | PeterLife и компания
использование материалов сайта разрешено с активной ссылкой на сайт
Яндекс.Метрика Яндекс цитирования